目的 优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。 方法 以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料，利用携带β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化，根据GUS的表达量及酶活性，筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系，分析落叶松scarecrow-like 6（LaSCL6）启动子的活性。 结果 瞬时转化后，GUS表达明显。当侵染液浓度OD₆₀₀为0.2，侵染5 min，共培养72 h时，GUS的表达量最高，∆C_T值为-2.274 2；当侵染液浓度OD₆₀₀为0.05，侵染5 min，共培养72 h时，GUS酶活性最高，为25.7286 U·L⁻¹。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。 结论 综合考虑GUS的表达量和酶活性，当侵染液浓度OD₆₀₀为0.05，侵染5 min，共培养24 h时，GUS的表达量和酶活性较高，这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。

运用qRT-PCR技术,检测日本落叶松种子萌发过程中的5个阶段——干种子 (萌发培养0 d)、吸胀(1 d)、萌动(5 d)、胚根外露(9 d)和子叶展开(28 d),miR156、miR159和miR160等18个miRNAs在其种胚内的表达模式,并对其目标基因进行生物信息学分析,探讨miRNA在针叶林木种子萌发过程中的基因表达模式。结果表明:(1)从整个萌发过程分析,18个miRNAs的表达水平皆以干种子阶段最高,吸胀和萌动阶段迅速下降;干种子阶段的表达水平分别是吸胀、萌动、胚根外露和子叶展开阶段的4.8 43.5、17.2 1 000.0、45.5 1 000.0、62.5 1 862.2倍。(2)从各个阶段分析,miR894的表达水平在5个阶段均最高,miR408均最低;其余16个miRNAs在5个阶段内的表达水平各有变化,综合排序结果从高到低依次为:miR951、miR950、miR156、miR159、miR396、miR398、miR390、miR160、miR947、miR165、miR319、miR162、miR171、miR397、miR395和miR172。(3)miRNA目标基因预测结果显示:目标基因主要是ATP/DNA结合蛋白、ARF等转录因子、质膜和核糖体等细胞组分及MAP等激酶活性蛋白等蛋白编码基因。(4)miR160对其目标基因JR160237 具有切割作用,切割位点发生在miR160与目标基因互补结合位点第10与11位碱基之间。JR160237在种子吸胀阶段表达水平迅速升高,在萌动、胚根外露和成苗阶段有所回落。

利用qRT-PCR技术分析了5个miRNAs(cin-miR157a、cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b和cin-miR396a)及其靶基因在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)不同发育阶段不同器官的表达变化。结果显示,5个miRNAs的表达模式均存在时空特异性,其中cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b、cin-miR396a在成年期营养器官中强烈表达,在幼年期和成年期生殖器官中弱表达;cin-miR157a在幼年期和成年期生殖器官中强烈表达,在成年期营养器官中弱表达。除cin-miR159a的靶基因MYB和cin-miR165a的靶基因HD-Zip Ⅲ外,其它被检测的miRNAs靶基因与相应的miRNAs的表达呈现出明显的相互消长的表达模式。该结果表明中间锦鸡儿miRNA可通过调控其靶基因的表达,进而调控发育阶段转变、器官形态建成、细胞分化等生物学过程。研究结果将为中间锦鸡儿的定向改良工作提供理论依据和基因资源。

非编码小RNA是一类长度约为20 26个核苷酸的内源性RNA分子,在植物中普遍存在,在转录和转录后过程调控基因表达。microRNA及其它非编码小RNA在植物个体生长发育和生理过程中起重要作用。microRNA及其它非编码小RNA在陆地植物中保守,而且每个进化分支的出现皆伴随着新microRNA和其它非编码小RNA的产生,这些现象都表明,非编码小RNA与陆地植物的系统发生密切相关。本文从microRNA及其它非编码小RNA的保守性并结合其功能,探讨了非编码小RNA在植物进化中的重要功能。

以2年生日本落叶松实生苗为材料构建其小RNA文库,对283个克隆进行PCR验证后测序,通过生物信息学分析鉴定文库中的microRNA并进行qRT-PCR验证。结果表明:(1)小RNA文库的体积为50 mL,总库容量为5.25×106 cfu,重组率为92.6%,插入片段长度约65 bp,与小RNA连接片段长度吻合。(2)去除rRNA(86个)、tRNA(14个)等非目的序列后,获得日本落叶松28个保守miRNAs,属于17个miRNA家族;其中,15个miRNAs(miR159c、miR160a、miR162a、miR164b、miR165a、miR166a、miR166a*、miR166b*、miR169a、miR169b、miR171a、miR171b、miR172a、miR319b、miR396a)的序列与其它植物完全一致,其余13个miRNAs(miR156a、miR159a、miR159b、miR164a、miR166b、miR168a、miR169b*、miR319a、miR396b、miR408、miR482a、miR2111、miR3701)则高度相似。(3)测序结果与本室落叶松转录组数据进行序列比对,新发现4个miRNAs (lle-miR1、lle-miR2、lle-miR3、lle-miR4)及其前体。(4)qRT-PCR验证表明,miR159a、miR159b等16个保守的和lle-miR1 lle-miR4等共20个miRNAs存在于日本落叶松中。(5)通过靶基因预测及UniProt数据库分析发现,32个miRNAs中有24个对应69个靶基因,其功能主要为转录因子、信号转导、胁迫抗性和代谢相关酶及未知功能蛋白。

本研究针对日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的31份材料,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,分析了12个持家基因(ACT 4、APm、Chc、Gapc、RPL1、RPL2、EF1、EF2、eIF、E3UL、UBQ和UPL2) 在这31份材料中的表达情况。经geNorm和NormFinder两种分析软件对这12个持家基因进行表达稳定性分析,结果表明:APm在不同器官、体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定;EF1 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定;eIF在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定。分析结果表明,针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基因做内参基因使用。进行基因表达细微差异研究时,可根据需要使用2个或2个以上内参组合。

目的 提高日本落叶松胚状体的萌发能力，优化日本落叶松良种繁育技术。 方法 本研究根据子叶数量和胚轴形态，对胚状体进行分类，并分别统计其萌发率；利用“滤纸容器法”对类型Ⅰ胚状体进行干化处理，统计其萌发情况。 结果 胚状体分为10种类型。类型Ⅰ胚状体萌发率为4.48%，其余类型胚状体难以萌发。干化处理14 d后，类型Ⅰ胚状体萌发率提高到69.43%，且具有干化响应的胚状体更易萌发。 结论 本研究表明日本落叶松胚状体干化处理后萌发率明显提高，为该物种良种繁育提供依据。

目的 研究落叶松体细胞胚萌发能力，为落叶松在应用方面规模化繁殖提供理论依据。 方法 以落叶松体胚性细胞系S287的成熟体细胞胚为材料，区分了落叶松体细胞胚的不同子叶形态；进行树脂切片及显微观察后，对其萌发能力进行了统计；并利用外源施用激素的方法研究了影响落叶松体胚再生成苗的重要因子。 结果 成熟的落叶松体细胞胚主要以四种形态存在，分别是正常子叶胚（NC ≥ 4），裂生子叶胚（2＜NC < 4），杯状胚（NC=1）以及畸形胚。纵切结构观察显示前三种体胚都能发育出完整的SAM和RAM，萌发率依次为17.2%，12.4%和5.7%，而畸形胚不具有完整的SAM和RAM，在萌发培养基上不能生根，并很快死亡。针对萌发率低的现状，进一步施用不同浓度的GA₃和IAA发现，只有2 mg·L^-1 IAA对落叶松体胚生根具有明显的促进作用，其萌发率达到了56%，且在后期存活率仍能保持较高水平。 结论 IAA在落叶松体细胞胚萌发中发挥重要的调控作用。

目的 研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应，为抗性育种提供候选基因。 方法 通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的cDNA全长，利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。 结果 从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的cDNA全长共计4 297 bp，GenBank登录号为KP277100。生物信息学分析表明，预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基，具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等，其等电点为6.35，不稳定指数为42.91，不具备信号肽，为非分泌蛋白，定位于细胞质中。定量PCR检测发现，CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低，在成年期的叶片中表达量较高；在干旱胁迫处理后的幼苗中，CiDR1表达水平有明显下降，表明该基因的表达受干旱抑制，可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。 结论 中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降，表明CiDR1的表达受干旱抑制，可能与中间锦鸡儿适应干旱相关，进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。